清光绪二十五年（1899年）初，周树人再次离家到南京，改考江南陆师学堂。恰巧在陆师学堂开办了矿路学堂，其性质与“格致书院”相似，因为附设在陆师学堂，故名称不叫书院而叫矿路学堂。周树人不能成为正式陆军学生，而是进入了矿路学堂。

矿路学堂创办于清光绪二十一年（1895年），是洋务派张之洞仿照德国体制搞起来的。他认为陆军与铁路有特殊关系，便在陆师学堂下设置一所铁路学堂。后来，刘坤一接任，听说南京附近的青龙山有蕴藏量丰富的煤矿，开煤矿非常有利可图，便决定在学堂里设置矿务班，培养一批具有开矿专门知识的人才。于是，便形成了矿路学堂。

矿路学堂的课程重点在开矿，以铁路为辅，开设有算学、格致（物理与化学）、金石学（矿物学）、地学（地质学）、历史等课程。这些课程，对周树人来说，一些自然科学初次接触，实在是非常新鲜。虽然画铁轨断面图什么的有些麻烦，但他过去是善长画画的。当时金石学有江南制造局的《金石识别》可用，地学却是要用手抄本的，他发挥了旧日影写画谱的本领，非常精细地照样子抄写了一部。

在矿路学堂学习期间，周树人学习十分勤奋刻苦。他在班上年龄最小，而成绩却是最好的。学堂里有规定，每月考试一次，考第一名的学生可以得到一枚三等银牌，有了四枚三等银牌可以换取一枚二等银牌，攒够四枚二等银牌又可以换取一枚五钱重的金牌。周树人是这个班中惟一的一名获得了金牌的学生。他得到金牌以后并不向别人炫耀，而是把它卖掉，将大部分钱寄给家里，一小部分钱留下来买书用了。他知道家里现在已经很困难，不可能接济他学习费用，学堂每月发给的津贴不够用，在矿路学堂读书期间的生活只能靠自己节俭了。冬天，学堂发放的棉衣薄得不足以御寒，他就多吃辣椒来增加体内热量，结果竟然养成了吃辣椒的习惯。

周树人处处注意节省，每次回家都是自己扛行李，不像别的学生那样找挑夫。在船上，当地的地痞无赖常常在开船前抢占船仓里睡觉的地方，然后卖给乘客收劝卧铺费”。大多数乘客都害怕这些地痞无赖，只好花钱买他们强占的铺位。但是，周树人偏偏不吃他们那一套，从来不花钱买他们的铺位，他把自己的行李往那儿一放，坐在行李上面眼睛微闭，任凭那些地痞无赖怎么样威吓就是不予理睬，如此对峙到要开船的时候，那些并不乘船的地痞无赖只好乖乖地滚蛋。于是，被那些地痞无赖抢占的地方空出来了，周树人从容地打开行李铺好便舒舒服服地一直睡到绍兴。在与地痞无赖的斗争中，他认识了社会恶势力的外强中干本性，一切恶势力并不可怕，必须和他们进行针锋相对的斗争。

矿路学堂的总办是由陆师学堂总办兼职的。当初陆师总办是钱德培，据说是绍兴“钱店官”出身，懂得德语，陆师学堂是按照德国体制办的，聘请的都是德国教官，所以这位总办就有用武之地了。后任的总办是俞明震（字恪士），虽然也是候补道，却是新派人士，是一位很开通的人。他思想活跃，每天坐在马车上还阅读维新派报纸《时务报》，给学生出国文题再也不是论管仲或汉高祖之类，而是出了一道《华盛顿论》，结果连国文教师都弄不明白，还要问学生华盛顿是个什么人。周树人对他一直很有敬意，在日记中说及这位总办时称他为“俞师”。

在总办俞明震的倡导下，学堂里设立了阅报处，不但有总办喜欢的《时务报》，还有传播国外新说的《译学汇编》。周树人每天都到这里来阅读。

周树人在南京修业期间，所得到的提高确实不校文史方面知识底子是在家里就打下的，而一般的自然科学知识则是在南京上学时学得的。此外加上一点《天演论》，便造成他的唯物思想的基矗一次，周树人从南京城南书店买到一本《天演论》，使他爱不释手